Charlotte Nachtsheim begann das Musizieren während ihrer Schulzeit in verschiedenen Kammerchören und in Gesangsstunden bei Martina Hennemann. Mit Beginn ihres Gesangsstudiums fokussierte sie sich auf das Repertoire der Alten Musik, insbesondere der Renaissance und des Frühbarocks. Sie studierte bei Evelyn Tubb an der Schola Cantorum Basiliensis. Dort rundete sie ihr Studium mit den Advanced Vocal Ensemble Studies unter der Leitung von Anthony Rooley und Evelyn Tubb ab. Sie ist Teil des Vokalensembles InVocare, das sich auf Polyphonie des 16. und 17. Jahrhunderts spezialisiert. Mit InVocare trat sie unter anderem beim Festival Oude Muziek Utrecht, Laus Polyphoniae in Antwerpen und an der Bayerischen Staatsoper München auf. In den letzten Jahren arbeitete sie für Projekte und Konzerte mit verschiedenen Ensembles zusammen, so zum Beispiel astrophil & stella, La Cetra, Ad Fontes, Concerto di Margherita, Zürcher Singakademie, ContraPunct_us, AUXantiqua und Le Miroir de Musique. Über die Musik hinaus widmet sie sich auch dem Studium der Kulturanthropologie und Geschlechterforschung an der Universität Basel.